运用多种方法提升儿童感染性疾病的实验诊断

作者：医院临床检验中心徐锦

随着计划免疫的实施,曾经严重危害儿童健康的脊髓灰质炎、结核、百日咳、破伤风、白喉等传染病已经得到了有效控制,但感染性疾病问题还远未得到解决。世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO）在年提出警告：“感染性疾病仍然是全世界健康事业的主要危害”,年全球仍有万5岁以下儿童死亡,大部分在发展中国家。在所有儿童的病死原因中,大约75%是由6种疾病导致的,包括新生儿期原因、肺炎、腹泻、疟疾、麻疹和人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征。而这些疾病的元凶都是病原微生物。病原微生物与人类不断斗争、互相适应并相互共存。原有的病原微生物在不断变异,新的病原微生物又不断出现,而且这些病原微生物往往导致儿童发病后引起较严重的后果。年严重急性呼吸综合征（severeacuterespiratorysyndrome,SARS）的出现、年亚洲10个国家和地区高致病性禽流感H5N1病毒的暴发流行、年至今发病人数仍居高不下的手足口病、年席卷世界的新型甲型H1N1流感、至年H7N9病毒在中国多个省份的流行及至年爆发流行的登革热,这些突发传染病的流行再次向我们敲响了警钟：必须重视应对儿童突发或新发传染病,必须早期诊断和及时治疗,努力降低其病死率。WHO计划年将儿童病死率在年的基础上进一步降低2/3,至年消除肺炎和腹泻。这个目标可谓任重而道远,是否能够有效控制感染性疾病的发生将是实现这个目标的关键。病原微生物的早期确定和准确鉴别对感染性疾病的预防及有效控制有非常重要的意义,特别是对于控制目前抗菌药物的过量使用以及在细菌性感染中不必要的抗病毒药物的使用意义重大。本专题的4篇论著紧紧围绕分子生物学新技术的研发和感染相关生物标志物的临床评价,突出了需要运用多种技术手段提升儿童感染性疾病诊断能力的必要性和迫切性。

一、分子生物学新技术的开发与评价

目前,病原学的诊断方法仍然依靠病原微生物培养、免疫学技术及分子生物学方法等。通常将培养法作为金标准,但由于病原微生物培养技术复杂、所需时间长,且有些病原微生物缺乏合适的培养方法,因此整体上培养法的敏感性较低。而免疫学技术的抗原或抗体检测也存在一定的局限性：病原体感染人体后往往3~5d后才产生特异的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）M抗体,新生儿因其免疫系统未发育成熟,有时难以有效地产生足量的可以检测到的IgM抗体。IgG抗体需在感染后采集急性期和恢复期的双份血清,方有明确的临床意义。但在临床上为每一位患儿采集双份血显然是难以做到的。抗原的检测则依赖于病原微生物抗原特异性单克隆抗体的制备,而且不同病原微生物之间存在的抗原交叉反应也会影响结果的判读。

分子生物学技术,特别是荧光定量聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）技术具有快速、敏感、特异、重复性好的特点,已经成为多种病原微生物的常规检测手段,成功用于病原微生物的鉴定。这种PCR技术有效弥补了培养和免疫学方法的缺陷,对于临床感染性疾病的诊断具有重要意义。目前,临床占有绝对优势的荧光定量PCR技术是基于DNA或RNA的DNA扩增技术,产物是DNA片段。尽管PCR对于临床病原微生物诊断而言是带来了革命性的进步,但在其应用过程中仍存在一些问题：（1）PCR所需的2步或3步温度的变化与循环对仪器的要求较高,而且医院检测;（2）由于病原微生物死亡后仍有DNA片段存在,因此检测到核酸并不能区分是否为活动性感染;（3）尽管是闭管操作,但由于扩增产物为DNA片段,容易由于操作不当或消毒不够而导致严重污染并难以去除;（4）易污染及为防止污染而设立的PCR3区使得样本抽提-上样-检测流程难以完全整合在一起,分子生物学技术的自动化难以实现。

这些PCR技术本身存在的问题促使更适合临床实验室应用的分子生物学技术的开发,其中依赖于RNA的等温条件下的RNA扩增技术,如依赖核酸序列扩增技术（nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA）和荧光恒温扩增技术（simultaneousamplificationandtesting,SAT）正是比较成熟的代表,已在美国等发达国家得到了较为广泛的应用。相对于普通的荧光定量PCR,这些技术具备以下的优势：（1）采用一步法等温扩增,避免了PCR的升降温步骤,降低了对仪器的要求,并有高效、快速的特点;（2）相对于Taq聚合酶,NASBA和SAT使用的T7RNA聚合酶受其他因素的影响更小,扩增效率更高;（3）由于是依赖于RNA的扩增,而活的病原微生物才能转录RNA,因此能够有效区分活动性感染和病原体杀灭后的恢复期,更利于疗效的评价;（4）NASBA和SAT的扩增产物均为RNA,容易降解,大大减少了实验室污染的风险;（5）污染风险的极大降低使得传统意义上的PCR3区可以融合成1个区,从而容易实现分子生物学检测流程的自动化,即抽提-扩增-检测可以在1个仪器中完成,可大大节省人力,提高工作效率[1,2,3]。本专题中由曹凌峰等撰写的论文《荧光恒温扩增技术检测单纯疱疹病毒Ⅰ型RNA方法的建立》,利用SAT建立了一种快速、可靠的单纯疱疹病毒Ⅰ型的检测方法,SAT与巢式PCR+测序方法的Kappa值为0.,其敏感性为.0%、特异性为97.0%,适用于单纯疱疹病毒性脑炎早期的快速诊断。杨海鸥等撰写的论文《依赖核酸序列扩增技术检测呼吸道合胞病毒方法的建立》,则在实验室内建立了NASBA检测呼吸道合胞病毒的方法。他们采用直接冻融法处理咽拭子样本,结果显示NASBA的灵敏度明显高于逆转录PCR,且特异性高、耗时相对较短,克服了目前实验室病毒检测方法的局限性,为呼吸道合胞病毒的检测提供了有效的实验室检测手段。

二、感染性疾病生物标志物的临床应用与评价

机体感染病原微生物后会发生一系列的生理和病理反应,并产生与感染密切相关的特异性的生物标志物。利用这些生物标志物可以帮助临床医生进行感染性疾病的诊断及鉴别诊断、指导抗菌药物或抗病毒药物的使用、评估病情进展程度、判断预后。因此,一个好的感染性疾病生物标志物应同时具有诊断、指导治疗、评估预后和随访的作用,并且其检测必须是敏感、快速和方便的,最好能够进行即时检验（point-of-caretest,POCT）。

生物标志物诊断效能的评价指标通常包括：敏感性、特异性和受试者工作特征曲线下面积。而其临床应用能力的评价是通过阳性预测值和阴性预测值得到的。在作生物标志物的临床验证或评价时要特别注意2点：（1）必须明确选择的研究对象是何种患者,同时设立正确的对照;（2）必须有明确定义某种感染的诊断金标准。

近年来,感染性疾病生物标志物领域得到了迅猛发展。经典的生物标志物,如C反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP）在儿科感染性疾病的诊断及鉴别诊断方面发挥了重要作用。而新的生物标志物,如降钙素原（procalcitonin,PCT）、血清淀粉样蛋白A（serumamyloidA,SAA）、干扰素-γ（interferon-gamma,IFN-γ）、白细胞介素6（interleukin6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α）方兴未艾,也已广泛应用于临床。另外尚有众多的候选生物标记物,如肾上腺髓质素、血纤维蛋白溶酶原受体（plasminogenreceptor）、肝素结合蛋白（heparin-bindingprotein,HBP）、脂多糖结合蛋白（lipolysaccharide-bindingprotein,LBP）、微小RNA（microRNA,miRNA）等尚在研究之中[6]。本专题中由沈伟虹等撰写的论文《血清淀粉样蛋白A与C反应蛋白联合检测在新生儿感染性疾病诊断中的应用评估》,通过检测80例新生儿感染性疾病患者及60名正常新生儿SAA、CRP和白细胞总数并作比较,认为SAA和CRP可作为新生儿感染性疾病诊断的重要指标,SAA较CRP更为敏感,SAA与CRP的联合检测能够提高新生儿感染性疾病的检出率,为疾病的早期诊断和监测提供实验室依据。

结核病仍然是严重危害人类健康的主要传染病,每年新发病例持续增多。传统的结核分枝杆菌实验诊断方法敏感性较低。结核分枝杆菌特异的T淋巴细胞可作为结核分枝杆菌感染的检测指标。干扰素-γ释放试验（interferon-gammareleaseassay,IGRA）是利用结核分枝杆菌感染者外周血中存在结核分枝杆菌特异性T淋巴细胞,这些T细胞再次接触结核分枝杆菌特异性抗原,发生增殖分化并释放IFN-γ的原理进行检测。IGRA检测结核感染的特异性达95%以上,敏感性达75%~97%,尤其适用于免疫抑制人群、潜伏结核感染者的诊断[7,8,9]。本专题中由钟华清等撰写的论文《干扰素-γ释放试验在儿童结核感染中的应用价值》,基于酶联免疫斑点法（enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT）的IGRA（即T-SPOT）检测了例非结核疾病患儿和34例活动性结核感染患儿体内特异性T淋巴细胞分泌的IFN-γ水平,评价其在儿童活动性结核病和潜伏结核感染中的敏感性和特异性,同时分析了该实验的各种影响因素。T-SPOT的敏感性为73.5%,特异性为99.0%,其结果与性别、年龄、卡介苗接种史、结核病接触史、机体免疫状态和感染部位无关。T-SPOT敏感性较高,特异性强,有助于儿童活动性结核病的早期快速诊断。

三、病原微生物基因型检测的临床应用

目前,依靠传统的血清型表型分析已不能满足病原微生物日益加快的变异速度及公共卫生的需求,因此,需要建立相应的基因信息库,同时建立基于现代分子生物学理论的基因分型技术。病原微生物基因分型的意义主要体现在流行病学、致病性分析和疫苗研制方面。基因分型可以帮助人们掌握病原微生物的分子流行病学特征,迅速查明毒（菌）株来源,追踪其在易患人群中的传播状况,切断传播路线,同时有助于临床医生认识不同患者特有的临床表现,探讨不同病原微生物基因型别与疾病发病机制之间的关系。在疫苗研制和使用上,欲达到某个病原微生物在该地区最大的保护作用,就必须充分了解该地区的基因型,做到疫苗的特异性使用。

巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）感染在人群当中非常普遍,大多数CMV感染为无症状感染,但在儿童中,有症状的CMV感染可引起严重后遗症。CMV包膜糖蛋白是病毒最外层的脂质双层包膜的主要成分,对病毒进入细胞及扩散有重要作用。本专题中由董妞妞撰写的综述《巨细胞病毒包膜糖蛋白B、H、N及其基因型的研究进展》,针对CMV的3种包膜糖蛋白：糖蛋白B（glycoproteinB,gB）、糖蛋白H（glycoproteinH,gH）、糖蛋白N（glycoproteinN,gN）,就其各自的基因型流行情况及与疾病相关性的国内外研究现状和进展作了总结。他们认为CMV感染时各基因型混合感染的情况非常普遍。虽然很多不同基因型的亚型与某些特定的疾病相关,但这些基因型都不能成为一种真正的预测指标,并且文中绝大多数为国外学者的研究成果,国内的研究还相对较少[11,12]。因此提示国内的研究者需深入研究我国人群的CMV糖蛋白基因型分布,以期为CMV的检测、治疗以及疫苗的研究提供新的证据。

四、结语

临床实验室可为感染性疾病的发现和诊疗提供依据。但当前绝大多数儿科临床实验室对感染性疾病的病原诊断能力仍是有限的,仅能对一些常见的病毒、细菌及真菌感染提供病原学诊断,并不能满足临床对各种病原微生物的快速诊断以及流行病学研究的要求,不能满足临床大量不明原因感染综合征的诊断需求,从而限制了临床早期预警、早期识别、及时救治生命以及早期制定合理的防控措施。针对当前的状况,我们需要融合各种技术手段、方法,建立和完善能用于临床和现场的各种快速诊断病原微生物或检测宿主生物标志物的诊断系统,为新发和再发感染性疾病的防控提供及时、有效的客观依据,真正提高临床一线对于感染性疾病的预警、预测和诊治能力。

参考文献（略）

来源：《检验医学》杂志,Vol.31

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