儿童EB病毒相关噬血细胞淋巴组织细胞增生

秦强，谢正德，刘春艳，黄志卓，王亚丽，张寒，赵晓曦，申昆玲

作者单位：首都医科医院

文章出处：中国循证儿科杂志,,7(2):-.

研究目的

在感染相关的继发性噬血细胞淋巴组织细胞增生症中，EB病毒相关噬血细胞淋巴组织细胞增生症（EpsteinBarrvirusassociatedhemophagocyticlymphohistiocytosis,EBV-HLH)占发病的50%以上，并且有着更差的预后。EBV-HLH多见于儿童，是严重威胁儿童健康的疾病之一。临床研究证实HLH患者存在不同程度NK细胞活性减低，因而国际组织细胞病协会在HLH诊断标准中将NK细胞活性减低作为依据之一。有研究显示，78例EBV-HLH患者予免疫治疗，随访43个月，57例（73.1%）存活，免疫治疗的有效性提示了EBV-HLH具有一定的免疫异常基础，并对进一步改善预后提供了可能。本课题组前期研究发现NK细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）基因多态性与EBV-HLH的发生相关。为进一步明确EBV-HLH患儿NK细胞受体表达及功能是否存在异常，本研究采用配对病例对照研究方法，对EBV-HLH患儿和正常儿童进行NK细胞受体表达和功能检测，以期能深入了解EBV-HLH的发病机制。■

－研究方法

研究组选取年8月至年5医院确诊为EBV-HLH、未接受过化学免疫治疗的住院患儿为EBV-HLH组，选取年龄、性别与EBV-HLH组1:1匹配的健康查体儿童为正常对照组。应用流式细胞仪检测NK细胞表面受体、穿孔素及CDa表达。予IL-2刺激后再次测定CDa表达情况。■

－研究结果

1.一般情况：年8月至年5月8例患儿确诊为EBV-HLH，均进行了PRF1，UNC13D，STX11及SH2D1A基因筛查，未见突变。EBV-HLH组和正常对照组的一般情况见表1。■

2.NK细胞表面受体和穿孔素表达情况：两组在NK细胞表面受体NKp30、NKp46、NKG2D、DNAM-1和2B4表达阳性率、CD56+NK细胞穿孔素表达率和在CD8+T细胞穿孔素表达率差异均无统计学意义（表2）。

3.IL-2刺激前后CDa表达：EBV-HLH组2例患儿因外周血淋巴细胞总数较低，提取的淋巴细胞数量不足以完成IL-2刺激前后CDa表达测定，予以排除，最终6例EBV-HLH患儿纳入分析。两组在IL-2刺激前CDa、CDa/K、CDa/2B4/P、CDa/NKG2D/P和CDa/2B4/NKG2D/P表达率差异均无统计学意义（表3）。两组在IL-2刺激后，NK细胞CDa表达差异亦无统计学意义（表3）。

EBV-HLH组在IL-2刺激前后CDa表达率差异无统计学意义。正常对照组IL-2刺激前后CDa、CDa/K和CDa/NKG2D/P表达率差异有统计学意义（表3）。

讨论和结论

本研究结果显示，EBV-HLH组和正常对照组间NK细胞表面受体和穿孔素表达率差异无统计学意义，提示EBV-HLH患儿NK细胞功能的异常可能存在着与HLH不同的机制。IL-2刺激后正常对照组CDa、CDa/K和CDa/NKG2D/P表达较刺激前显著提高，EBV-HLH组较刺激前差异未见统计学意义。提示EBV-HLH组NK细胞对IL-2的反应出现异常，可能与EBV-HLH的发生有关。

51Cr释放实验是检测NK细胞毒活性的金标准，但51Cr具有半衰期短和放射性等缺点。其他实验如乳酸脱氢酶(LDH)释放法，受其敏感性低的缺点，也未能广泛开展。溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1,或CDa)是一种高糖基化的蛋白，约占溶酶体膜蛋白的50%。NK细胞杀伤靶细胞时，毒性颗粒将到达浆膜面并与细胞膜融合，引起颗粒内容物释放，最终导致靶细胞的死亡。随着脱颗粒的发生，CDa分子被转运到细胞膜表面，并且CDl07a分子的表达上调与穿孔素的分泌一致。因此，CDl07a表达率的变化可以反映NK细胞杀伤活性的改变。

穿孔素受到多种细胞因子的调节，包括IL-2、lL-4、IL-6、IL-7、IL-12和IFN等都能够增加穿孔素表达。穿孔素和颗粒酶的表达降低受TGF-β作用、感染的迁延、病毒的致病力或肿瘤的影响，从而降低NK细胞的细胞毒作用。有研究表明造血干细胞移植后血清颗粒酶、穿孔素水平的升高与CMV感染有明显的相关性，其升高的水平不仅可以预测CMV的发生．还可以评估抗CMV的治疗。但目前尚没有EBV感染后相关研究的报道，本研究中，EBV-HLH组在CD56+NK细胞和CD8+T细胞中穿孔素的表达和正常对照组间未发现显著差异。因此，参照同属于疱疹病毒科的CMV的研究结果，推测如EBV-HLH患儿穿孔素表达异常，除进行基因筛查排除遗传因素外，应注意其对常规治疗的反应，是否能成为临床预后较差的指标，还有待于进一步大样本的研究结果。

IL-2作用的靶细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和B细胞，可以引起效应T细胞和B细胞的克隆性扩增。同时IL-2可促进NK细胞的增殖和分化，增强其细胞毒杀伤作用。本研究EBV-HLH组在IL-2的刺激下，NK细胞CDa、CDa/NKG2D表达率未见显著变化，与正常对照组不一致，从而不能正常的杀伤受EBV感染的细胞，导致感染的持续存在及机体免疫系统的持续激活。这同时也能解释部分EBV感染患儿在没有明显免疫缺陷或基因缺陷的情况下，发生噬血现象的原因。

Marcenaro等在对FLH的研究中发现，从FHL2型（PRF基因缺陷）和FHL3型（MUNC13-4基因缺陷）患者中分离的NK细胞，在经过体外培养和IL-2刺激后，FHL3型组对K靶细胞的杀伤作用明显降低。进一步研究提示，NKp30、NKG2D、2B4、CD16等表面受体表达也存在差异。但本研究发现，EBV-HLH组NKp30、NKp46等表面受体及穿孔素表达与正常对照组差异无统计学意义，提示EBV-HLH的发病机制与FHL存在不同，需要进一步研究。

本研究的不足之处和局限性：①由于EBV-HLH发病机制不清，临床诊断困难，且入选病例需要未经过化疗的患儿，病例来源较少。②由于实验步骤较多，受外界因素影响较大，尽管每检测1例患儿，同时都会选取1例相匹配的正常对照，尽量做到条件一致，但外周血单核细胞计数差别较大，而实验所添加的抗体的量是一致的，使数据离散度较大。③本研究未设立单纯EBV感染组，对于NK细胞活性的改变是由EBV所致、HLH所致抑或是EBV和HLH的共同作用无法更确切地说明。

本期编辑整理秦强焦伟伟

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